In der Erzählung des Buches Daniel im Alten Testament veranstaltet Belsazar, König von Babylon, ein frevelhaftes Festmahl und nutzt die heiligen Gefäße, die von Nebukadnezar aus dem Tempel Salomos geraubt wurden. Während des Festes erscheint eine geisterhafte Hand und schreibt an die Wand מנא מנא תקל ופרסין (mene, mene, tekel, ufarsin). Die Weisen des Reiches scheitern an der Deutung der Botschaft, nur der Prophet Daniel kann sie entschlüsseln – möglicherweise, wie Menasseh Ben Israel– Nachbar, Rabbiner und Freund Rembrandts – vorschlug, wegen der vertikalen Ausrichtung und Leserichtung von rechts nach links. Daniel enthüllt die Bedeutung der Worte: „Du bist auf der Waage gewogen und zu leicht befunden worden; dein Reich wird geteilt und den Medern und Persern übergeben.“.
Noch in derselben Nacht wird Belsazar getötet und die göttliche Prophezeiung erfüllt sich.
Das Werk entfernt sich vom Idealismus und taucht ein in einen realistischen Barock, wobei es Details wie Falten, Kleidung und Körperhaltungen betont. Das diagonale Licht erzeugt lebendige Reflexe und verleiht der Szene eine dynamische, visuell und emotional explosive Wirkung.